Pourtant, le penseur florentin est mort depuis quarante-cinq ans lorsque survient le massacre. Dans son ouvrage Le Prince, rédigé en 1513 et publié après sa mort en 1532, Machiavel analyse les moyens permettant à un dirigeant de conserver son pouvoir et de préserver l’État. Sa notion de virtù désigne le fait qu’un prince compétent doit savoir utiliser aussi bien la force que la ruse. Il écrit notamment que le souverain le plus apte à gouverner est celui qui est capable de faire varier sa conduite entre le bien et le mal, « selon que la fortune et les circonstances l’exigent ».
La pensée de Machiavel est cependant plus complexe que l’image du dirigeant « démoniaque » qui s’impose progressivement en France. Dans les Discours sur la première décade de Tite-Live, il défend notamment l’idée que le peuple peut être plus compétent que les princes et les rois pour préserver sa liberté. Il insiste ainsi sur l’importance des institutions et de la participation populaire dans le maintien d’un État efficace. Surtout, lorsqu’il évoque l’usage de la violence, Machiavel ne recommande pas une cruauté illimitée : il défend plutôt une violence concentrée et maîtrisée, destinée à atteindre un objectif politique précis. La Saint-Barthélemy, avec l’ampleur et la durée des massacres, est donc loin de correspondre mécaniquement à cette conception.
C’est précisément cet écart qui permet aux adversaires politiques des Valois de transformer la pensée machiavélienne. Dès 1574, une conception française du « machiavélisme » se construit, qui entretient alors peu de rapports avec le contenu effectif des écrits de Machiavel. On emploie alors péjorativement le terme de machiavélisme pour désigner une manière de gouverner cruelle, utilisant la ruse sans scrupules et de façon irrationnelle. Cette nouvelle définition apparaît surtout lors des affrontements politiques et religieux qui déchirent le royaume pendant les guerres de Religion. En 1576, l’avocat protestant Innocent Gentillet donne à cette construction une forme particulièrement influente. Dans son Discours sur les moyens de bien gouverner et maintenir en bonne paix un royaume ou autre principauté, rapidement connu sous le nom d’Anti-Machiavel, il s’attaque directement à la doctrine du Florentin. Son ouvrage, entièrement consacré à Machiavel, cherche à prouver méthodiquement que ses principes seraient responsables des mauvaises pratiques politiques observées en France.
Pour les opposants protestants au pouvoir royal, l’enjeu dépasse alors la seule philosophie politique. Les guerres de Religion opposent des catholiques et des protestants dans une lutte à la fois religieuse, politique et dynastique. Accuser les conseillers du roi de suivre Machiavel permet de donner une cohérence idéologique aux violences attribuées au pouvoir des Valois. Dans un pamphlet protestant intitulé Epistre aux delicats et flateurs machiavelistes, les conseillers de Charles IX sont ainsi décrits comme des « perfides » qui « s’attachent au conseil de Machiaveli », lequel préférerait « la rigueur et cruauté du prince à toute douceur et humanité ».
La figure de Catherine de Médicis renforce également cette association. Reine consort de France d’origine florentine, elle devient une cible privilégiée des accusations visant l’influence italienne à la cour. Deux de ses proches conseillers italiens, Jacopo Corbinelli et Bartolomeo d’Elbène, connaissent directement les écrits de Machiavel. Leur présence contribue à alimenter les soupçons autour du « parti italien ». Dans ce contexte, l’origine italienne de Machiavel fournit aux adversaires des Valois un outil supplémentaire pour dénoncer une supposée influence étrangère sur la politique française.
Cette nouvelle lecture sélectionne certains passages du Prince, les détache de leur contexte et les associe aux événements politiques français. Le « machiavélisme » devient alors moins une doctrine précisément définie qu’une accusation politique. Selon Ariane Boltanski, chercheuse à l’Institut universitaire européen de Florence, la conception du machiavélisme qui apparaît en France à partir de 1574 constitue ainsi une construction idéologique en grande partie inédite, directement liée aux polémiques françaises et aux affrontements religieux du royaume.